二化螟解毒代谢相关酯酶基因的筛选和表达分析

【摘要】二化螟Chilosuppressalis(Walker)是水稻的重要害虫之一,对我国水稻的稳产、高产造成严重的影响,尤其在我国南方稻区经常连年爆发,为害严重,造成巨大的经济损失。长期以来,防治二化螟主要以化学防治为主,有机磷类、氨基甲酸酯类等类杀虫剂在二化螟防治中都得到广泛的使用,但是持续、大量、尤其是不合理的使用杀虫剂,也给二化螟造成很大的抗性选择压力,致使我国不同地区的二化螟对常用的杀虫剂都产生了不同水平的抗性。害虫抗药性涉及到表皮穿透能力下降、解毒代谢能力增强和靶标分子敏感性下降。酯酶基因点突变、基因扩增和表达量上升是导致昆虫体内解毒代谢能力增强的重要机制。此外,酯酶是一个庞大的超基因家族,在昆虫体内不仅参与外源化合物的解毒,还具有营养代谢、信息传导调控,以及保幼激素的代谢调控等重要功能。本文利用转录组数据,对二化螟体内的酯酶基因进行了克隆验证,并利用诱导试验筛选杀虫剂代谢相关酯酶基因,克隆其全长,为进一步分析不同酯酶在不同杀虫剂代谢中的作用提供理论依据。现将研究结果总结如下：1.酯酶基因筛选验证及杀虫剂可诱导基因的分析为了弄清二化螟体内参与杀虫剂解毒代谢的酯酶基因,本章利用二化螟转录组数据,首先对各种酯酶基因进行了筛选和扩增验证,结果获得了68条不同的羧酸酯酶基因序列。此后通过诱导试验,利用半定量RT-PCR对比分析不同酯酶在三唑磷和氯虫苯甲酰胺诱导前后的表达量变化,通过电泳条带的亮度寻找与解毒代谢相关的基因。结果发现,经氯虫苯甲酰胺诱导后,供试二化螟体内68条酯酶基因中有4条,Cs.EXE2、Cs.EXE4、Cs.EXE5、Cs.EXE6表达量明显升高,三唑磷诱导后也有4条基因的表达量明显上升,分别是Cs.EXE1、Cs.EXE3、Cs.EXE4、Cs.EXE5,其中有2条与氯虫苯甲酰胺诱导的基因相同。分析认为这些基因可能分别参与了这2中杀虫剂的解毒代谢,属于杀虫剂代谢相关的酯酶基因。2.二化螟酯酶基因的全长克隆及同源性分析本研究采用RACE技术将半定量筛选到的与二化螟解毒代谢相关的六个酯酶基因进行全长克隆,分别命名为Cs.EXEl、Cs.EXE2、Cs.EXE3、Cs.EXE4、Cs.EXE5、Cs.EXE6,并利用序列分析软件对全长序列进行分析。结果表明,六个基因的cDNA全长在1700bp-2500bp之间,开放阅读框(ORF)在1400bp-1700bp之间,编码约479-560个氨基酸,除Cs.EXE2外,Cs.EXEl,Cs.EXE3,Cs.EXE4,Cs.EXE5和Cs.EXE6的催化三联体结构Ser-Glu-His,活性中心均具有为GXSXG结构,均具有酯酶基因的保守序列。经过同源性比对和系统进化树分析,目的基因与家蚕、蜜蜂、赤拟谷盗等昆虫酯酶基因存在极高的相似性,大都在84-99%之间。上述结果进一步证实所克隆的6个基因是二化螟的酯酶基因。3.解毒代谢相关的酯酶基因的表达分析由于二化螟酯酶基因较多,序列结构相似性较高,为了避免利用转录组数据中筛选片段进行半定量RT-PCR分析可能出现的错误,本研究利用全长酯酶基因和定量PCR技术,对半定量RT-PCR筛选到的6个基因,重新进行诱导验证。检测氯虫苯甲酰胺和三唑磷诱导前后目的基因的表达量情况,结果表明,通过定量PCR检测到的目的基因的表达量与半定量RT-PCR筛选到的基因的表达趋势相同,这6个酯酶基因的表达量在诱导后都出现了明显的上调,氯虫苯甲酰胺诱导后4个相关酯酶基因的表达量上升了2.5-3.5倍,三唑磷诱导后,其相关酯酶基因的表达量是对照表达量的1.5-7.5倍之间。这些研究结果进一步证实,这6个酯酶基因是二化螟体内可诱导的酯酶基因,与氯虫苯甲酰胺和三唑磷等杀虫剂的解毒代谢有关。
【作者】王莹；
【导师】韩召军；
【作者基本信息】南京农业大学，农业昆虫与害虫防治，2013，硕士
【关键词】二化螟；转录组数据；解毒代谢相关酯酶；三唑磷；氯虫苯甲酰胺；基因克隆；表达量分析；

【参考文献】
[1]王建林,于贵瑞,王伯伦,齐华,徐正进.北方粳稻光合速率、气孔导度对光强和CO_2浓度的响应[J].植物生态学报,2005,01:16-25.
[2]张兴美.第三人撤销之诉研究[D].吉林大学,诉讼法学,2014,硕士.
[3]宗亚飞.叉车节能技术仿真研究[D].太原科技大学,车辆工程,2014,硕士.
[4]杨彦伟.Notch受体和配体在原发性肝细胞癌中的表达及其意义[D].新乡医学院,外科学,2012,硕士.
[5]刘国栋.转铁蛋白修饰的载阿霉素氧化石墨烯纳米粒抗胶质瘤实验研究[D].苏州大学,2013.
[6]罗端能.提速列车餐车厨房排气装置的改进及试验[J].铁道机车车辆.2000(05)
[7]曾庆环.844例消化道黏膜下肿瘤临床病理分析及长期随访研究[D].中国人民解放军医学院,老年医学,2013,硕士.
[8]安锦王建伟.资源诅咒:测度修正与政策改进[J].中国人口.资源与环境,2015,03:.
[9]韩德成,张铁浩,陈东方,韩建民,孟立春,方喜风.高速列车用7N01铝合金搅拌头选择及接头性能研究[J].热加工工艺,2015,03:223-225.
[10]徐慧.河南省自考助学政策执行研究[D].郑州大学,行政管理（专业学位）,2013,硕士.
[11]陈凯亮.燃气蒸汽联合循环发电机组故障诊断方法研究及应用[D].浙江大学,热能工程,2013,硕士.
[12]唐红,张世璐.基于数据仓库的本地网网络管理决策支持系统[J].计算机科学,2001,05:67-70.
[13]李章剑.血管内超声（IVUS）换能器仿真设计与研制[D].中国科学院研究生院(长春光学精密机械与物理研究所),光学工程（专业学位）,2013,硕士.
[14]葛宝金,王连俊,李丹枫,李懿.大秦重载铁路路基基床表层静力学性能及状态[J].北京交通大学学报,2014,04:143-147.
[15]季丽丽.基于UML状态图的测试用例自动生成研究[D].南京航空航天大学,计算机应用技术,2004,硕士.
[16]赖斌.四川科教旅游公司外部环境分析及对策[D].西南交通大学,2002.
[17]李春龙.拟南芥AtNRGA1与AtGPK1参与植物干旱胁迫响应的机理研究[D].山东大学,细胞生物学,2014,博士.
[18]宋澄.防空武器系统打击能力研究[D].哈尔滨工业大学,控制科学与工程,2013,硕士.
[19]刘静.不同拉伸方式作用下下肢刚度与爆发力的关系[D].北京体育大学,体育教学,2013,硕士.
[20]王雁.中草药型添加剂对紫花苜蓿青贮品质的影响[D].四川农业大学,草业科学,2012,硕士.
[21]田湉.以翻译美学为指导比较《包法利夫人》李健吾译本和许渊冲译本中四字格的应用[D].北京外国语大学,法语口译,2014,硕士.
[22]邢军峰.中国民营银行准入的研究[D].河南大学,国民经济学,2004,硕士.
[23]栾春娟.新媒体介入下的电视节目形态创新分析[D].新疆大学,新闻传播,2013,硕士.
[24]邢峰.基于教学目标设计作业的影响因素研究—对两位小学数学教师的考察[D].宁波大学,课程与教学论,2014,硕士.
[25]李岳梅.人本概念设计[J].计算机辅助设计与制造,2001,05:6-8.
[26]袁婉秋.右美托咪定用于经鼻盲探气管插管的效果研究[D].广西医科大学,麻醉学,2013,硕士.
[27]王阳.《二十年目睹之怪现状》量词研究[D].河北大学,语言学及应用语言学,2014,硕士.
[28]鲁荣光.一起绵羊痘的诊断及病原分离鉴定[D].吉林大学,兽医,2014,硕士.
[29]杨辉.语文阅读教学中多媒体运用的误区分析及对策思考[D].扬州大学,课程与教学论,2012,硕士.
[30]张永健.青岛市A医院设备管理研究[D].西安工业大学,工商管理（专业学位）,2014,硕士.
[31]庄逸慧.汉语初级口语课堂的会话分析[D].华中科技大学,语言学及应用语言学,2012,硕士.
[32]王晨,韩览山,薛四新,邵贝恩.基于多维数据仓库的集团化企业总部EIS[A].中国自动化学会控制理论专业委员会.第二十届中国控制会议论文集（下）[C].中国自动化学会控制理论专业委员会:,2001:5.
[33]梁洋.试构建我国税务执法和解制度的程序法体系[J].现代经济信息,2014,16:352-353.
[34]蔺海莉.蛇根木异胡豆苷糖苷酶及Vinorine合成酶表达、纯化、抑制剂抑制机理和复合物三维结构研究[D].浙江大学,药学,2013,硕士.
[35]李阿瑾.黄浦江上游近自然林与纯林涵养水源能力比较[D].华东师范大学,生态学,2013,硕士.
[36]李毅,孙正兴,陈松乐,李骞.基于退火粒子群优化的单目视频人体姿态分析方法[J].自动化学报,2012,05:732-741.
[37]卫雅楠.中小城市生活垃圾污染防治法律制度研究[D].山西财经大学,环境与资源保护法学,2014,硕士.
[38]李思慧.词块对初中生英语课堂教学影响的研究[D].辽宁师范大学,学科教学（专业学位）,2012,硕士.
[39]吴延明.多元智能理论视阈下中职院校健美操教学的实验研究[D].南京体育学院,运动训练（专业学位）,2012,硕士.
[40]丁娟娟.授权氛围与工作投入：心理授权的中介作用[D].华中师范大学,企业管理（专业学位）,2012,硕士.
[41]张渝阳.稀散元素硒、碲量子点的合成和应用及其催化动力学分析方法的研究[D].华东师范大学,2009.
[42]王勇.数据仓库中数据查询优化方法的研究与应用[D].湖南大学,软件工程,2011,硕士.
[43]张伟强.地理信息技术辅助高中地理教学的应用研究[D].西北师范大学,农村教育,2013,硕士.
[44]刘丽芳.商业数据仓库系统的设计与实施[D].北京工业大学,2002.
[45]苏琳涵.裕固族、汉族人群乳铁蛋白基因多态性与龋病易感性的研究[D].兰州大学,口腔临床医学,2013,硕士.
[46]王宏青.中国石油化工股份有限公司环境会计信息披露诊断分析[D].兰州大学,会计,2014,硕士.
[47]秦晓东.细数“IT监理”[J].中国计算机用户.2002(45)
[48]王博.100T新型节能液压机设计的关键技术研究[D].上海工程技术大学,材料加工工程,2011,硕士.
[49]黄佳.团队多元化，知识管理与团队绩效的关系研究[D].浙江工商大学,企业管理,2014,硕士.
[50]李连甲.上海市企业环境信用评价体系构建研究[D].东华大学,环境工程（专业学位）,2014,硕士.